4.WYNIKI (dokumentację fotograficzną umieściłem  tutaj)

4.1. BADANIA ENZYMATYCZNE ( Tabela I, wykresy I i II)

4.1.1. Grupa kontrolna

Badanie poziomu enzymów w surowicy krwi wykazało średni poziom AspAT 164,0 IU/l (odchylenie standardowe - SD ą 14,2) i średni poziom AlAT 36,2 IU/l (SD ą 7,2).

4.1.2. Grupa I (zwierzęta, które otrzymały tylko cyklofosfamid)

Średni poziom AspAT w surowicy krwi w 8. dniu doświadczenia wynosił 316,4 IU/l (SD ą 11,6), a w 10. dniu - 457,6 IU/l (SD ą 11,3) i w obu przypadkach był to wzrost statystycznie istotny w porównaniu do średniego poziomu tego enzymu w grupie kontrolnej (p < 0,01). W 14. dniu średni poziom AspAT obniżył się do 181,2 IU/l (SD ą 13).

Średni poziom AlAT w 8. dniu osiągnął 49,6 IU/l (SD ą 5,3), a w 10. dniu - 66,2 IU/l (SD ą 7,1) - również te różnice były istotnie znamienne w porównaniu z grupą kontrolną.

W 14. dniu doświadczenia wartości AlAT nie różniły się istotnie od poziomu w grupie kontrolnej osiągając poziom 44,8 IU/l (SD ą 7,2).

4.1.3. Grupa II (zwierzęta, które otrzymywały pentoksyfilinę)

Średni poziom AspAT w surowicy krwi w 8. dniu doświadczenia wynosił 166,0 IU/l (SD ą 13,9), w 10. dniu doświadczenia - 180,8 IU/l (SD ą 13,0), a w 14. dniu doświadczenia 177,6 IU/l (SD ą 7,1). Wartości te nie wykazywały istotności statystycznej.

Średni poziom AlAT w 8. dniu wynosił 43 IU/l (SD ą 5,5), w 10. dniu - 43,4 IU/l (SD ą 5,2), a w 14. dniu - 41,8 IU/l (SD ą ) - również i te wartości nie wykazywały znamienności statystycznej w porównaniu do wyników w pozostałych grupach zwierząt.

4.1.4. Grupa III (zwierzęta, które otrzymały zarówno cyklofosfamid, jak i pentoksyfilinę)

Średni poziom AspAT w surowicy krwi u tej grupy zwierząt w 8. dniu doświadczenia osiągnął 281,4 IU/l (SD ą 17,2), a w 10. dniu doświadczenia - 490,0 IU/l (SD ą 20,1) co było statystycznie znamiennym wzrostem w porównaniu do grupy kontrolnej. W 14. dniu doświadczenia - średni poziom enzymu wynosił 180,2 IU/l (SD ą 14,9).

Średni poziom AlAT w 8. dniu doświadczenia wynosił 40,8 IU/l (SD ą 3,5), w 10. dniu - 82,6 IU/l (SD ą 9,6), a w 14. dniu - 45,8 IU/l (SD ą 8,1). Średni poziom AlAT w 10. dniu doświadczenia był w sposób statystycznie znamienny wyższy niż w grupie kontrolnej.

4.2. BADANIA HISTOLOGICZNE I HISTOCHEMICZNE (TABELA II)

4.2.1. Grupa kontrolna

4.2.1.1. Obraz histologiczny

W obrazie mikroskopu optycznego wieloboczne komórki miąższowe - hepatocyty tworzyły regularne beleczki ułożone promieniście ku żyle środkowej.

Cytoplazma ich była kwasochłonna, lekko ziarnista. Jedno, rzadziej dwa jądra o regularnych obrysach, miały równomiernie ułożoną chromatynę jądrową z często widocznym, silnie zasadochłonnym jąderkiem.

Komórki śródbłonka zatok oraz komórki Browicza-Kupffera były spłaszczone, a w świetle zatok znajdowały się nieliczne krwinki czerwone.

4.2.1.2. Odczyn na aktywność dehydrogenazy bursztynianowej ( SDH )

Dodatni odczyn na aktywność SDH, w postaci drobnych, zlewających się ziarnistości formazanu, widoczny był w cytoplazmie hepatocytów strefy środkowej i pośredniej zrazika. W strefie obwodowej odczyn był silnie dodatni.

4.2.1.3. Odczyn na aktywność dehydrogenazy mleczanowej ( LDH )

Silnie dodatni odczyn na LDH występował w hepatocytach wszystkich stref zrazika wątrobowego.

4.2.1.4. Odczyn na aktywność fosfatazy kwaśnej ( AcP )

Odczyn, w postaci ciemnobrunatnych ziarnistości, zlokalizowany był w strefie okołokanalikowej komórek miąższowych oraz w komórkach Browicza - Kupffera. W strefie środkowej i pośredniej odczyn był dodatni, w strefie obwodowej silnie dodatni.

4.2.1.5. Odczyn p.a.S. na glikogen

W odczynie p.a.S. po blokowaniu dimedonem buraczkowe ziarna glikogenu wypełniały cytoplazmę wszystkich hepatocytów.

4.2.1.6. Odczyn na tłuszcze obojętne

Był ujemny we wszystkich komórkach wątrobowych.

4.2.2. Grupa I (zwierzęta, które otrzymały tylko cyklofosfamid)

4.2.2.1. Obraz histologiczny

W 8. dniu doświadczenia budowa zrazikowa wątroby była zachowana, a niektóre żyły środkowe miały poszerzone światło. Cytoplazma hepatocytów strefy obwodowej była silnie ziarnista, mniej kwasochłonna niż w hepatocytach w pozostałych strefach zrazików wątrobowych.

W 10. dniu budowa zrazikowa wątroby była nieco zatarta. Cytoplazma licznych hepatocytów strefy obwodowej zrazików wykazywała cechy zwyrodnienia wodniczkowego. W obrębie zatok widoczne były pobudzone komórki Browicza-Kupffera.

W 14. dniu obraz mikroskopowy wątroby nie różnił się od stwierdzanego w grupie kontrolnej.

4.2.2.2. Odczyn na aktywność dehydrogenazy bursztynianowej ( SDH )

W 8. dniu doświadczenia odczyn na aktywność SDH w komórkach miąższowych strefy środkowej był silnie dodatni, w strefie pośredniej i obwodowej - dodatni.

W 10. dniu tylko część komórek strefy środkowej wykazywała odczyn silnie dodatni, inne dodatni. W strefie pośredniej odczyn był słabo dodatni lub dodatni i w strefie obwodowej dodatni.

W 14. dniu odczyn na aktywność SDH, podobnie jak w grupie kontrolnej, był dodatni w strefie środkowej i pośredniej oraz silnie dodatni w strefie obwodowej.

4.2.2.3. Odczyn na aktywność dehydrogenazy mleczanowej ( LDH )

W 8. doświadczenia dniu w cytoplazmie hepatocytów wszystkich stref zrazików wątrobowych odczyn był silnie dodatni.

W 10. dniu odczyn w hepatocytach strefy środkowej był silnie dodatni, część hepatocytów strefy pośredniej i obwodowej wykazywała odczyn dodatni, w pozostałych komórkach miąższowych strefy obwodowej oraz pośredniej odczyn był silnie dodatni.

W 14. dniu, podobnie jak w grupie kontrolnej, odczyn we wszystkich strefach zrazika był silnie dodatni.

4.2.2.4. Odczyn na aktywność fosfatazy kwaśnej ( AcP )

W 8. dniu doświadczenia odczyn we wszystkich strefach zrazika był dodatni. W cytoplazmie niektórych hepatocytów, głównie strefy środkowej, odczyn był silnie dodatni - brunatne ziarna układające się wzdłuż kanalików żółciowych tworzyły grudkowate skupienia.

W 10. dniu odczyn w strefie środkowej był silnie dodatni, w strefie pośredniej i obwodowej - dodatni.

W 14. dniu jedynie w niektórych hepatocytach strefy środkowej odczyn był silnie dodatni, w pozostałych komórkach miąższowych odczyn był dodatni.

4.2.2.5. Odczyn p.a.S. na glikogen

W 8. dniu doświadczenia w strefie środkowej zrazików niektóre komórki wykazywały odczyn słabo dodatni, inne dodatni. W strefie pośredniej i obwo-dowej, w cytoplazmie niektórych hepatocytów odczyn był ujemny, w innych słabo dodatni lub dodatni.

W 10. dniu w cytoplazmie komórek wszystkich stref zrazików wątrobowych odczyn był ujemny lub słabo dodatni.

W 14. dniu odczyn na glikogen we wszystkich strefach zrazików był dodatni, jedynie nieliczne komórki strefy obwodowej wykazywały odczyn słabo dodatni lub ujemny.

4.2.2.6. Odczyn na tłuszcze obojętne

We wszystkich hepatocytach odczyn był ujemny.

4.2.3. Grupa II (zwierzęta, które otrzymywały pentoksyfilinę)

4.1.3.1. Obraz histologiczny

W 8. dniu doświadczenia obraz mikroskopowy wątroby nie różnił się od opisywanego w grupie kontrolnej.

W 10. dniu widoczne było poszerzenie żył środkowych oraz nagromadzenie erytrocytów w zatokach wątrobowych.

W 14. dniu, podobnie jak w 8. dniu, żadnych zmian patologicznych w obrazie mikroskopowym wątroby nie znaleziono.

4.2.3.2. Odczyn na aktywność dehydrogenazy bursztynianowej ( SDH )

W 8. dniu doświadczenia odczyn na aktywność SDH w strefie środkowej i pośredniej był dodatni, w strefie obwodowej silnie dodatni.

W 10. dniu niektóre komórki strefy środkowej i pośredniej wykazywały odczyn silnie dodatni, w pozostałych odczyn był dodatni.

W 14. dniu odczyn w cytoplazmie hepatocytów strefy środkowej i pośredniej był dodatni, w obrębie strefy obwodowej silnie dodatni.

4.2.3.3. Odczyn na aktywność dehydrogenazy mleczanowej ( LDH )

W 8. dniu doświadczenia odczyn na LDH był silnie dodatni w hepatocytach wszystkich stref zrazików.

W 10. dniu, w cytoplazmie niektórych hepatocytów strefy obwodowej odczyn był dodatni,
w pozostałych komórkach miąższowych strefy obwodowej oraz w strefach środkowej i pośredniej odczyn był silnie dodatni.

W 14. dniu odczyn w hepatocytach wszystkich stref zrazików był silnie dodatni.

4.2.3.4. Odczyn na aktywność fosfatazy kwaśnej ( AcP )

W 8. dniu doświadczenia w hepatocytach wszystkich stref zrazików odczyn był dodatni.

W 10. dniu, w komórkach strefy środkowej odczyn był dodatni lub słabo dodatni, w pozostałych hepatocytach odczyn był dodatni.

W 14. dniu, podobnie jak w 8. dniu, odczyn na AcP w cytoplazmie wszystkich hepatocytów był dodatni.

4.2.3.5. Odczyn p.a.S. na glikogen

W 8. dniu doświadczenia odczyn na glikogen był dodatni lub silnie dodatni w niektórych hepatocytach szczególnie strefy środkowej i pośredniej.

W 10. dniu odczyn był nierównomierny: większość hepatocytów wszystkich stref wykazywała odczyn dodatni lub słabo dodatni.

W 14. dniu odczyn we wszystkich komórkach miąższowych był dodatni.

4.2.3.6. Odczyn na tłuszcze obojętne

Odczyn na tłuszcze obojętne w cytoplazmie hepatocytów był ujemny.

4.2.4. Grupa III (zwierzęta, które otrzymały zarówno cyklofosfamid, jak i pentoksyfilinę)

4.2.4.1. Obraz histologiczny

W 8. dniu doświadczenia budowa zrazikowa wątroby była nieco zatarta, żyły środkowe poszerzone, a w cytoplazmie niektórych hepatocytów strefy obwodowej zrazików widoczne były cechy zwyrodnienia wodniczkowego.

W 10. dniu, obok zatarcia budowy zrazikowej wątroby, stwierdzono poszerzenie żył środkowych i zatok naczyniowych, a w ich świetle widoczne były pobudzone komórki Browicza-Kupffera, granulocyty obojętnochłonne oraz pojedyncze megakariocyty.

Cytoplazma hepatocytów, głównie w strefie pośredniej i obwodowej, wykazywała cechy zwyrodnienia wodniczkowego.

W 14. dniu budowa zrazikowa wątroby była wyraźna i jedynie nieliczne hepatocyty strefy obwodowej wykazywały cechy zwyrodnienia wodniczkowego. Komórki śródbłonka zatok oraz komórki Browicza-Kupffera były spłaszczone. W świetle zatok widoczne były nieliczne erytrocyty. W cytoplazmie komórek obwodowych stref zrazików widoczne były puste przestrzenie
po wyługowanym tłuszczu.

4.2.4.2. Odczyn na aktywność dehydrogenazy bursztynianowej ( SDH )

W 8. dniu doświadczenia odczyn na SDH we wszystkich strefach zrazików był silnie dodatni.

W 10. dniu w strefie środkowej odczyn był dodatni, w strefach pośredniej i obwodowej - dodatni i słabo dodatni.

W 14. dniu odczyn w strefie środkowej i pośredniej był dodatni, w strefie obwodowej silnie dodatni.

4.2.4.3. Odczyn na aktywność dehydrogenazy mleczanowej ( LDH )

W 8. dniu doświadczenia odczyn na aktywność LDH był silnie dodatni w cytoplazmie hepatocytów strefy środkowej oraz silnie dodatni lub dodatni w komórkach strefy pośredniej i obwodowej.

W 10. dniu, w niektórych komórkach strefy środkowej odczyn był silnie dodatni, w pozostałych komórkach wszystkich trzech stref - dodatni lub słabo dodatni.

W 14. dniu odczyn był silnie dodatni w hepatocytach wszystkich stref zrazików.

4.2.4.4. Odczyn na aktywność fosfatazy kwaśnej ( AcP )

W 8. dniu doświadczenia odczyn na aktywność AcP był dodatni we wszystkich strefach zrazików, a w niektórych komórkach strefy środkowej - silnie dodatni.

W 10. dniu większość komórek wszystkich stref zrazików wykazywała odczyn silnie dodatni.

W 14. dniu odczyn we wszystkich strefach zrazików był dodatni, jedynie niektóre komórki miąższowe strefy środkowej wykazywały odczyn silnie dodatni.

4.2.4.5. Odczyn p.a.S. na glikogen

W 8. dniu doświadczenia w większości komórek wszystkich stref zrazików odczyn był ujemny, w nielicznych komórkach dodatni lub silnie dodatni.

W 10 i 14. dniu odczyn we wszystkich strefach zrazika był słabo dodatni lub ujemny. W niektórych jądrach komórkowych odczyn był silnie dodatni.

4.2.4.6. Odczyn na tłuszcze obojętne

Po 14. dniu doświadczenia w cytoplazmie niektórych hepatocytów strefy obwodowej zrazików odczyn był dodatni .

4.3. BADANIA ULTRASTRUKTURALNE

4.3.1. Grupa kontrolna

Poszczególne hepatocyty wykazywały pewne różnice w strukturze, kształcie, rozmiarze i ilości organelli komórkowych.

Jądra komórkowe hepatocytów miały okrągły lub owalny kształt, równe obrysy i regularnie rozproszoną chromatynę oraz jedno, rzadziej dwa jąderka położone centralnie.

Mitochondria były owalne, zawierały macierz o średniej gęstości elektro-nowej i krótkie grzebienie.

Aparaty Golgiego były zwykle słabo rozwinięte, a w ich sąsiedztwie znajdowały się nieliczne lizosomy. Ziarnistości glikogenu formowały rozetki rozproszone w całej cytoplazmie, skupiające się w większych ilościach wokół jądra.

Kanały sieci endoplazmatycznej szorstkiej były wąskie, krótkie, o regularnym układzie, natomiast nieliczne pęcherzyki siateczki gładkiej znajdowały się w pobliżu aparatu Golgiego i na obwodzie komórki.

Peroksysomy były nieliczne. Światła kanalików żółciowych posiadały na swej powierzchni liczne, regularnie ułożone mikrokosmki. W biegunie naczyniowym obserwowano czasem krople lipidowe.

Przestrzenie Dissego były wąskie, zawierały liczne mikrokosmki i graniczyły z komórkami śródbłonka.

4.3.2. Grupa I (zwierzęta, które otrzymały tylko cyklofosfamid)

W 8. dniu doświadczenia w obrazie mikroskopu elektronowego jądra komórkowe hepatocytów były owalne lub okrągłe, czasem o nieco pofałdowanych brzegach - posiadały duże, jedno lub dwa, jąderka.

Mitochondria były ciemne, z zagęszczoną macierzą, o wyraźnie zróżnicowanej wielkości i kształcie. Niektóre z nich były wydłużone i zwierały struktury parakrystaliczne układające się zwykle wzdłuż organelli. Towarzyszyło temu często odcinkowe zatarcie struktury błon ograniczających mitochondria. Ponadto występowały liczne, duże i silnie osmofilne ciała intramitochondrialne.

Aparaty Golgiego były pobudzone, miały poszerzone cysterny, wewnątrz których znajdował się materiał o średniej gęstości elektronowej.

Glikogen, w postaci rozetek rozproszony był w cytoplazmie.

Występowała czasem ogniskowa degranulacja sieci endoplazmatycznej szorstkiej, natomiast sieć endoplazmatyczna gładka uległa wyraźnej proliferacji. Tworzyła ona liczne kanały pomiędzy którymi znajdowały się ziarnistości glikogenu.

Nieliczne lizosomy skupione były wokół kanalików żółciowych o nieco zmniejszonych światłach.

Niektóre hepatocyty w biegunie naczyniowym miały nieregularnie rozmieszczone mikrokosmki.

Śródbłonki naczyń zatokowych były obrzmiałe.

W 10. dniu jądra komórkowe nadal miały nierówne obrysy i jedno lub dwa rozbudowane jąderka. Często obserwowano komórki dwujądrowe oraz podziały mitotyczne.

Mitochondria były liczne, różnokształtne, o zagęszczonej macierzy i nieco zatartej strukturze wewnętrznej, czasem nie była zachowana ciągłość błon ograniczających. Niektóre mitochondria zawierały struktury parakrystaliczne, w innych widoczne były wyraźne przewężenia, w miejscu których zwykle zatarta była ciągłość błon ograniczających, co świadczyć może o podziale mitochondriów i tworzeniu się dwóch odrębnych organelli.

Cysterny aparatu Golgiego były mocno poszerzone i wypełnione materiałem o średniej gęstości elektronowej. W pobliżu znajdowały się lizosomy pierwotne oraz ciałka wielopęcherzykowe. Glikogenu było bardzo mało, natomiast bardzo liczne były peroksysomy.

Sieć gładka wykazywała cechy znacznej proliferacji. Liczne lizosomy skupione były wokół kanalików żółciowych o nieco zwężonych światłach, wewnątrz których znajdowały się czasem struktury błoniaste.

Śródbłonki naczyń zatokowych były wyraźnie obrzmiałe, czasem trudno było prześledzić ich ciągłość. Komórki Browicza-Kupffera zawierały duże ilości fagosomów i lizosomów. W świetle naczyń obserwowano limfocyty, płytki krwi, makrofagi oraz fragmenty uszkodzonych hepatocytów.

W 14. dniu doświadczenia obraz ultrastrukturalny hepatocytów uległ wyraźnej normalizacji. Jądra komórkowe miały regularne kształty, nie spotykano mitochondriów ze strukturami parakrystalicznymi.

Sieci endoplazmatyczne szorstka i gładka nie wykazywały istotnych odchyleń od normy. Aparaty Golgiego również nie wykazywały cech pobudzenia Spotykano czasem autofagosomy zawierające fragmenty uszkodzonych organelli

Komórki wyściółki śródbłonkowej były niezmienione. Komórki Browicza-Kupffera wykazywały wyraźne cechy pobudzenia.

4.3.3. Grupa II (zwierzęta, które otrzymywały pentoksyfilinę)

W 8. i 10. dniu doświadczenia zmiany były jakościowo podobne. Jądra komórkowe hepatocytów były owalne lub okrągłe, z dużymi, rozbudowanymi jąderkami.

Mitochondria, miały mocno zmienione kształty, zagęszczoną, osmofilną macierz i nieco zatartą strukturę grzebieni. Spotykano czasem mitochondria ze strukturami parakrystalicznymi.

Obserwowano aparaty Golgiego z wyraźnymi cechami pobudzenia.

Zwracał uwagę wzrost ilości peroksysomów. Pozostałe organella komórkowe nie wykazywały istotnych zmian.

Bieguny naczyniowe hepatocytów miały często wygładzoną powierzchnię lub nieregularnie rozmieszczone, różnokształtne mikrokosmki wpuklające się do światła zatok. Stwierdzano odcinkowy brak wyściółki śródbłonkowej oraz obrzmienie komórek śródbłonka.

W 14. dniu doświadczenia obraz ultrastrukturalny hepatocytów nie wykazywał istotnych zmian. Budowa większości mitochondriów nie odbiegała od normy i nie obserwowano w nich obecności wtrętów parakrystalicznych.

4.3.4. Grupa III (zwierzęta, które otrzymały zarówno cyklofosfamid, jak i pentoksyfilinę)

W 8. dniu doświadczenia jądra komórek wątrobowych miały pofałdowane brzegi i pobudzone, duże jąderka. Mitochondria były wyraźnie zmienione: miały dziwaczne kształty, mocno zagęszczoną, osmofilną macierz, zatartą strukturę wewnętrzną z dużymi ciałami intramitochondrialnymi o wysokiej gęstości elektronowej oraz odcinkowy brak błon ograniczających. Częściej niż w grupie I obserwowano wydłużone mitochondria zawierające parakrystaliczne wtręty.

Aparaty Golgiego były rozbudowane, a sieć endoplazmatyczna gładka tworzyła liczne pęcherzyki, które łączyły się ze sobą i tworzyły nieregularne kanały. Stwierdzano niewielką ilość glikogenu. Ponadto zaobserwowano wyraźnie zwiększoną liczbę lizosomów wokół kanalików żółciowych o znacznie zmniejszonych światłach.

Hepatocyty od strony zatok miały nieregularnie rozmieszczone różnokształtne mikrokosmki. Czasem większe fragmenty hepatocytów, zwykle pozbawione organelli wpuklały się do światła naczynia.

Śródbłonki często były obrzmiałe, a czasem obserwowano brak ciągłości wyściółki śródbłonkowej.

W 10. dniu doświadczenia charakter i nasilenie zmian ultrastrukturalnych były podobne jak po 8 dniach. Ponadto zaobserwowano wyraźny wzrost ilości i wielkości peroksysomów oraz wodniczki wypełnione drobnoziarnistą substancją o średniej gęstości elektronowej.

Szczególnie silnie zaznaczone były zmiany w okolicach biegunów naczyniowych komórek, gdzie liczne fragmenty uszkodzonych hepatocytów znajdowały się w przestrzeni Dissego oraz w świetle zatok.

Komórki śródbłonka były silnie obrzmiałe. Często spotykano komórki Browicza-Kupffera zawierające liczne lizosomy i fagosomy oraz komórki Ito z dużymi kroplami lipidowymi.

Po 14 dniach doświadczenia zmiany w większości komórek były mniej nasilone - jądra, sieć endoplazmatyczna szorstka i gładka, aparaty Golgiego nie wykazywały uchwytnych zmian. Widoczna była duża ilość ziaren glikogenu.

Obraz większości mitochondriów nie różnił się od obrazu prawidłowego. W niektórych komórkach mitochondria były jednak wyraźnie zmienione: miały różnorodne kształty, mocno zagęszczoną macierz, nieco zatartą strukturę wewnętrzną.

Utrzymywała się duża aktywność lizosomalna - wokół kanalików obserwowano liczne lizosomy oraz fagosomy. W przestrzeniach Dissego oraz pomiędzy hepatocytami obserwowano włókna kolagenowe. W zatokach występowały fragmenty uszkodzonych hepatocytów i liczne komórki Browicza-Kupffera obładowane sfagocytowanym materiałem.