3. MATERIAŁ I METODY
3.1. PROTOKÓŁ DOŚWIADCZENIA
Badania wykonano na 51 szczurach, samcach rasy Wistar o masie ciała 180-220 g. Zwierzęta przebywały w nasłonecznionym pokoju o temperaturze 18-20 oC i otrzymywały standardowy pokarm granulowany.
3.1.1.Grupy doświadczalne:
I grupa (15 zwierząt) otrzymała w 7. dniu doświadczenia dootrzewnowo cyklofosfamid (jednowodny 2-tlenek 2-[bis-(2-chloroetylo)-amino}-tetrahydro-2H-1,3,2-oksazafosforynowy) firmy Asta (Endoxan) w dawce 150 mg/kg masy ciała, rozpuszczony w 1 ml zbuforowanego roztworu soli fizjologicznej (PBS).
II grupa (15 zwierząt) otrzymywała codziennie, od 1. do 10. dnia doświadczenia pentoksyfilinę (1-(5-oksoheksylo)-3,7-dwumetyloksantyna) firmy Hoechst (Torental) w wodzie do picia w dawce 30 mg/kg masy ciała na dobę (1-(5?-oksoheksylo)-3,7-dwumetyloksantyna) firmy Hoechst (Torental) w wodzie do picia w dawce
III grupa (15 zwierząt) otrzymywała codziennie, od 1. do 10. dnia doświadczenia pentoksyfilinę w wodzie do picia w dawce 30 mg/kg masy ciała na dobę. W 7. dniu zwierzętom podano jednorazowo dootrzewnowo cyklofosfamid w dawce 150 mg/kg masy ciała rozpuszczony w 1 ml PBS.
Grupa kontrolna (6 zwierząt) otrzymywała do picia czystą wodę, a w 7. dniu doświadczenia zwierzętom podano jednorazowo dootrzewnowo 1 ml PBS.
Zwierzęta uśmiercano (po 5 w grupach I, II i III oraz po 2 w grupie kontrolnej) przez dootrzewnowe podanie 100 mg roztworu pentobarbitalu sodu firmy Abbot (Nembutal) w 8., 10. i 14. dniu doświadczenia (tj. po 1, 3 i 7 dniach od podania cyklofosfamidu w I. i III. grupach doświadczalnych).
3.2. METODY BADAŃ
3.2.1. Badania enzymatyczne
Z lewej komory serca każdego szczura, (przed uśmierceniem) pobierano po 2 ml krwi, w surowicy której oznaczano poziom aminotransferazy asparaginianowej (AspAT) i aminotransferazy alaninowej (AlAT) metodą spektrofotometryczno-kinetyczną (w Zakładzie Diagnostyki Analitycznej AM w Białymstoku).
Wyniki badań enzymatycznych poddano analizie statystycznej przy zastosowaniu testu t-Studenta. Obliczono dla każdej grupy zwierząt, w poszczególnych przedziałach czasowych: średnią, odchylenie standardowe oraz znamienność statystyczną.
3.2.2.Badania histologiczne i histochemiczne
Wycinki do badań histologicznych i histochemicznych pobierano z części środkowej prawego płata wątroby. Utrwalano je w 10% zobojętnionej formalinie oraz zamrażano w ciekłym azocie.
Skrawki uzyskane metodą parafinową barwiono hematoksyliną i eozyną oraz wykonano na nich odczyn p.a.S. po blokowaniu dimedonem wg Mc. Manusa na glikogen.
Wycinki zamrożone i skrojone w kriostacie posłużyły do wykonania następujących odczynów histochemicznych:
1) na aktywność dehydrogenazy bursztynianowej (SDH) - EC.1.3.99.1 wg Nachlasa i Seligmana,
2) na aktywność dehydrogenazy mleczanowej (LDH) - EC.1.1.1.27 wg Pearse'a,
3) na aktywność fosfatazy kwaśnej (AcP) - E.C. 3.1.3.2 wg Gomoriego oraz
4) barwienia czerwienią oleistą (oil red) na tłuszcze obojętne.
Badanie kontrolne dla odczynu p.a.S. stanowiło trawienie skrawków diastazą, a dla badań histoenzymatycznych - inkubacja skrawków bez substratu.
Ocenę nasilenia odczynów histochemicznych przeprowadzono przy użyciu następującej umownej skali półilościowej:
0 - odczyn ujemny,
+ - odczyn słabo dodatni,
++ - odczyn dodatni,
+++ - odczyn silnie dodatni.
3.2.3.Badania ultrastrukturalne
Do badań ultrastrukturalnych pobierano wycinki ze środkowej części prawego płata wątroby, po 5 od każdego zwierzęcia, każdy o objętości około 1 mm3. Utrwalano je w 3,6% roztworze aldehydu glutarowego w 1 M buforze kakodylowym o pH 7,4 w temperaturze 4 oC przez 2 godz. Następnie dotrwalano w 2% czterotlenku osmu w buforze Milloniga o pH 7,4, po czym skrawki odwadniano w szeregu alkoholowym i tlenku propylenu i zatapiano w Eponie 812.
Preparaty półcienkie skrawano na ultramikrotomie Reichert-Young firmy Leica, następnie barwiono błękitem toluidyny i dokonywano wstępnej oceny w mikroskopie świetlnym.
Skrawki ultracienkie kontrastowano octanem uranylu i cytrynianem ołowiu i oceniano przy pomocy transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) firmy Opton 900.
W każdej z badanych grup doświadczalnych wykonano 45 elektronogramów, a w grupie kontrolnej - 10.